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Il laboratorio IIT@Sapienza nasce in seguito a un progetto di ricerca sottomesso nel 2010, pdf Project CLNS (826 KB), e svolge le proprie attività attorno a due tematiche di interesse biomedico dove l’innovazione tecnologica è la chiave per raggiungere gli obbiettivi: i disordini neurodegenerativi e i tumori cerebrali.

I disordini neurodegenerativi, con condizioni ereditarie o meno, sono caratterizzati da disfunzioni progressive del sistema nervoso. I tumori del cervello sono a tutt’oggi fra le patologie più pericolose per la vita degli adulti e nell’infanzia. Entrambi i progetti di ricerca beneficiano della realizzazione e convergenza di piattaforme tecnologiche comuni, le quali comprendono sia una strumentazione commerciale avanzata, sia nuove tecnologie sviluppate dal Centro stesso.

Divisioni

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è uno dei disordini degenerativi neuromuscolari più devastanti per l’uomo, caratterizzato da degenerazione moto-neuronica progressiva (MN), atrofia muscolare e paralisi letale.

Nonostante gli sforzi degli ricerca biomedica in questo campo, molti aspetti dell’ezio-patologia della SLA rimangono ancora oscuri, in particolare per quanto riguarda il meccanismo responsabile della compromissione delle funzioni fisiologiche durante il progredire della malattia.

Il progetto di ricerca ha lo scopo di applicare le nanotecnologie più innovative come strumento per chiarire i processi molecolari, cellulari e tissutali alla base del differenziamento e omeostasi del sistema nervoso. La conoscenza dettagliata di questi processi in cellule sane permetterà la comprensione del loro malfunzionamento durante la degenerazione neuromuscolare

Unità di ricerca: Motoneuroni di topo

Tra i numerosi geni coinvolti nella generazione e progressione della SLA, questa unità di ricerca si occupa del gene che codifica per la proteina FUS/TLS (FUS) che lega l’RNA in modo pleiotropico, e le cui mutazioni sono state trovate nel 4% dei casi di SLA familiare. Questa attività di ricerca si basa sull’uso di cellule embrionali staminali (mESC) come modello per studiare il ruolo di FUS nell’eziopatogenesi molecolare della SLA.

Unità di Ricerca: iPSCs umane

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) forniscono un’opportunità di ricerca per lo studio delle malattie nell’uomo, quando modelli più specifici non sono disponibili. Abbiamo ottenuto cellule SLA-iPSC che possono generare motoneuroni o cellule muscolari in vitro. Questo sistema cellulare riassume i marcatori chiave della patologia, come per esempio la localizzazione anomala delle proteine mutate in risposta allo stress cellulare, e possono esser utilizzate per studiare la correlazione tra mutazioni ed eziopatologia della SLA

Unità di Ricerca: muscoli scheletrici di topo

L’unità è impegnata nell’analisi istologica, molecolare, funzionale e biomeccanica sia di muscoli scheletrici che del sistema nervoso negli animali modello SLA.

Unità di ricerca: Elettrofisiologia

L’unità sviluppa la registrazione di immagini dell’attività elettrofisiologica risolta in tempo di cellule neuronali e microgliali per caratterizzare la loro interazione in condizioni fisiologiche e patologiche (SLA e tumori cerebrali).

Unità di Ricerca: Biochimica

L’unità è specializzata in ingegneria proteica utilizzando metodi di modifica genetica e chimica. In particolare, le differenti proteine di trasporto sono disegnate, clonate, espresse e purificate. Queste sono perciò utilizzate per il rilascio di prodotti farmaceutici, sonde diagnostiche e acidi nucleici in cellule e tessuti.

I tumori del cervello sono fra le malattie più pericolose sia nella vita adulta che durante l’infanzia. Nonostante i recenti progressi nella diagnosi e nel trattamento, le capacità di prognosi rimangono insufficienti. E’ quindi necessario lavorare per il miglioramento delle attuali tecnologie chirurgiche e di registrazione di immagini, così come al miglioramento della caratterizzazione genetica/epigenetica delle specifiche popolazioni di cellule tumorali selezionate.

Un problema cruciale è legato alla presenza di cellule staminali tumorali nel cervello (CSC) che rappresentano una riserva di cellule tumorali, che alimentano e mantengono i tumori e la loro progressione.

Il progetto di ricerca è principalmente impegnato in: 1) sviluppare tecnologie di registrazione di immagini in-vivo per migliorare il rilevamento di tumori durante la delineazione intra-operativa di un potenziale tumore cerebrale; 2) comprendere la biologia e la dinamica della popolazione CSC e i segnali molecolari delle vie metaboliche patogeniche che sostengono CSC (come i segnali Hedgehog e Notch). Lo scopo finale è quello di identificare agenti teranostici (ovvero terapeutici e diagnostici) da usare nella diagnosi e nelle procedure successive. Una specifica enfasi è data a nanoparticelle teranostiche e multifunzionali basate sul rilascio di agenti aventi come bersaglio le vie metaboliche del segnale molecolare CSC- specifico e la neo-angiogenesi.

Laboratori e piattaforme di Supporto sperimentale

Questo progetto ambizioso è condotto nei laboratori del Centro, all’interno di un ampio locale equipaggiato con diverse stazioni di lavoro di biologia molecolare e cellulare, che includono: camere sterili per coltura cellulare e tissutale, laboratorio con rischio biologico per le colture cellulari in sicurezza BSL3, camera di microbiologia, camera oscura, e stanza strumenti. Tra le strumentazioni disponibili abbiamo: Real Time Viia7, thermal cyclers, Luminometer, Chemidoc, Nanodrop, Cryostat.

Piattaforme di supporto sperimentale

La piattaforma di genomica si rivolge a progetti di sequenziamento e analisi dell’espressione genica condotti sia all’interno che all’esterno del Centro. Questa piattaforma integrata fornisce un servizio completo alla comunità scientifica di riferimento ed è dedicata al conseguimento dell’eccellenza operazionale, al disegno del processo avanzato, alla visualizzazione e analisi dei dati, e allo sviluppo tecnologico. La piattaforma di genomica è equipaggiata con Illumina Hiseq 1500, Miseq, NanoString nCounter, strumentazione convenzionale e tecnologie di supporto per la preparazione dei campioni e la generazione di librerie convalidate.

La struttura di Bioinformatica supporta i ricercatori dell’IIT nell’analisi dei dati di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Il complesso è sostenuto da una piattaforma computazionale ad alta prestazione la cui architettura è specificamente concepita per l’analisi dei dati genomici:

  • Gateway to Illumina Miseq and Hiseq sequencers
  • HP Enclosure with 11 blades
  • HPC cluster with 9 nodes for parallel computing
  • 130+ cores up to 512GB RAM
  • 60+ Terabytes of SAN storage
  • Lustre parallel file system supporting HPC simulation environment
  • Tape library.

La struttura partecipa a vari progetti e collaborazioni, fornisce i programmi di analisi dati NGS più usati, disegnando canali specifici per diversi tipi di dati genomici e sviluppando strumenti personalizzati di bioinformatica. Sono offerti livelli avanzati e standard di analisi NGS che includono: sequenziamento RNA-seq, miR-seq, ChIP-seq, exome completo e sequenziamento del genoma (WES, WGS). (WES, WGS).

Il bioprinting è una tecnologia che crea costrutti cellulari viventi attraverso la deposizione 3D di materiale biologico, strato dopo strato, consistente in componenti cellulari e di matrice cellulare (inchiostro bio), e trova applicazione nello sviluppo di modelli di tessuto bio-mimetico per studi in-vitro o per la produzione di tessuti di sostituzione, funzionali e trapiantabili, nell’ingegneria tissutale. In particolare, il Centro sta sviluppando un sistema di bioprinting basato sull’estrusione micro-fluidica di fibre di idrogel contenenti cellule in coltura. Differenti idrogel con proprietà chimiche e meccaniche modificabili sono utilizzati come supporto per matrici extracellulari, in grado di ricreare un ambiente 3D per colture cellulari.

Il laboratorio di citometria a flusso del Centro è equipaggiato con due strumenti a base laser, con il principale scopo di caratterizzare ed isolare una varietà di popolazione cellulare sia di origine umana che di topo. La tecnologia di questi strumenti permette un’analisi simultanea, multi-parametrica, di migliaia di cellule per secondo, per una rapida analisi di complesse popolazioni cellulari. Questo è raggiunto grazie all’uso di differenti anticorpi marcati o coloranti che mirano a molecole specifiche espresse sulla superficie o nel citoplasma delle cellule, permettendo di studiare i dettagli di un campione complesso o per identificare un sottoinsieme di cellule espresse con bassa frequenza.

Con questi strumenti, fluorocromi legati a differenti anticorpi sono in grado di identificare specifiche molecole all’interno di una data cellula, quindi di caratterizzarla (citometria a flusso) e, finalmente, di selezionare specifici bersagli per isolamento (selezionatore cellulare).

L’analizzatore cellulare BD LSRFortessa è un citometro a cinque sorgenti laser (488nm, UV 355nm, V 405nm, 561nm e 640nm) e 18 rilevatori di fluorescenza gestito dal software BD FACSDiva su XP.

Le caratteristiche dell’analizzatore di cellule sono:

  • Identificare le cellule usando anticorpi per superfici specifiche e marcatori intracellulari;
  • discriminare cellule transfettate usando sonde specifiche (per esempio GFP, RFP etc)
  • studiare la proliferazione cellulare (CFSE…) apoptosi e/o morte cellulare (Annexin-V, 7-AAD).

Il BD FACSAriaIII è un selezionatore di cellule a quattro sorgenti laser (488nm, 375nm, 561 nm e 640nm) e 10 rilevatori di fluorescenza programma gestito dal software BD FACSDiva su XP.

I dettagli del selezionatore cellulare sono:

  • Selezionare fino a quattro popolazioni cellulari;
  • Isolamento di cellule singole;
  • Capacità di selezionare in tubi (1,5ml, 5ml, 15ml), in pozzetti multipli (6, 24, 48, 96 e 384 pozzetti), vetrini a scomparti (2 o 8 wells) e vetrini standard.

 

Il complesso di Imaging presso il Centro include sia strumenti commerciali che all’avanguardia, con lo scopo di fornire un completo panorama di tecniche per affrontare attività di ricerca in campo biomedico. Queste includono:

  • Microscopio confocale a scansione a singolo e due fotoni
  • Microscopio confocale spinningidsk
  • Microscopia non lineare per registrazione di immagini CARS e SRS.
  • Nano-Microscopia IR
  • Nano-Microscopia Raman.
  • Microscopia a luce strutturata
  • Optogenetics.

Il principale scopo del laboratorio è di disegnare sistemi micro e nano-fluidici per applicazioni biomediche. Stiamo al momento lavorando allo sviluppo di modelli di vasi sanguigni su chip e sul disegno di un nano-poro basato su sensori per l’analisi di singole molecole di proteine e peptidi. Inoltre, stiamo lavorando a linee di ricerca fondamentale che riguardano la cavitazione, micro-nuotatori, e flussi a multifase nel micro-scala.

Il laboratorio è equipaggiato con un apparato per micro PIV per misurare la velocità del campo di flusso nella microscala (laser pulsato, microscopio invertito, fotocamera a doppio fotogramma), una fotocamera a elevata velocità e un set di pompe per manipolare piccoli volumi di fluido. Il laboratorio porta avanti anche simulazioni numeriche che vanno dal modello atomistico alla dinamica di fluido continuo.

Una struttura di colture cellulari dà sostegno alle attività di ricerca dei due progetti principali (A1 e A2) fornendo l’equipaggiamento appropriato per il lavoro legato alle colture cellulari di mammifero. Lo scopo di questo complesso è quello di fornire una piattaforma comune per portare avanti esperimenti sulle cellule e mantenere e conservare linee cellulari sperimentali. Una cappa a flusso laminare con stereoscopio dedicato alla riprogrammazione cellulare è organizzato per cellule staminali pluripotenti umane e di topo.