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Il Centro per l’Innovazione delle Nanotecnologie (CNI) è un centro di R&D interdisciplinare che si dedica allo studio e la valorizzazione dei fenomeni osservati alla nanoscala. Il Centro è parte dei laboratori NEST della Scuola Normale di Pisa. Le linee di ricerca vanno dalla medicina molecolare alla realizzazione di nuovi nano-diagnostici, dall’ingegneria e disegno dei materiali 2D, alla cristallografia elettronica ai nuovi metodi avanzati di microscopia.

Divisioni

Microscopia Avanzata

Cristallografia Elettronica

La dicitura “cristallografia ad elettroni” si associa a tutti gli studi di cristallografia condotti utilizzando gli elettroni come radiazione sia in diffrazione che in imaging. Il microscopio elettronico a trasmissione ZEISS libra 120 presso CNI@NEST è stato configurato come stazione di diffrazione elettronica per studi di cristallografia ad elettroni.

Tomografia in diffrazione elettronica: questa attività di ricerca è incentrata sul metodo di tomografia in diffrazione elettronica assistita da precessione del fascio (PEDT), con particolare interesse alla sua applicazione nello studio di campioni fortemente sensibili al fascio elettronico come composti organici, farmaceutici e proteine Sui materiali inorganici “resistenti” la nostra stazione di cristallografia ad elettroni è già in grado di fornire dati di diffrazione sia per la risoluzione che per l’affinamento strutturale (affinamento dinamico) su cristalli piccoli, a partire da un centinaio di nanometri. Stiamo al momento sviluppando una procedura completamente automatica di raccolta dati (EDT veloce) che, associata con una nuova fotocamera molto sensibile (MEDIPIX), permetterà una raccolta dati veloce in meno di 1 minuto, riducendo drasticamente la dose elettronica assorbita dal campione. Ci aspettiamo nel prossimo futuro di esser in grado di raccogliere dati su campioni vetrificati contenenti nanocristalli di proteine. Tali raccolte potranno essere adatte a determinare la struttura cristallina della proteina esaminata.

Analisi di tessitura alla nanoscala: Analisi di tessitura alla nanoscala: questa attività è basata sul Sistema ASTAR per mappe di fase ed orientamento cristallino con diffrazione elettronica. La ricerca attualmente in corso ci permetterà di aumentare la risoluzione e la velocità di raccolta dati usando il rilevatore MEDIPIX come strumento di registrazione. Utilizzando la sua sensibilità ci aspettiamo di portare la risoluzione alla minima dimensione consentita del fascio che è di 1.4 nm. Possibili applicazioni: analisi del politipismo di farmaci alla nanoscala, valutazione del rapporto nanocristallino amorfo in campioni sensibili al fascio.

Tecnica correlativa TEM, Micro-CT

Il laboratorio sta sviluppando nuovi metodi di correlazione tra la tomografia a raggi X (micro-CT, in collaborazione con linea di fascio SYRMEP presso Elettra – Sincrotrone Trieste) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La ricostruzione tomografica 3D di interi organi e/o tessuti già inclusi e fissati per analisi TEM permette di identificare la regione di interesse (normalmente marcatori patologici) con la risoluzione intrinseca di pochi micron, caratteristica del Micro-CT. Il campione può quindi esser tagliato tramite ultra-microtomo proprio a ridosso della regione di interesse precedentemente identificata per ottenere una sezione adatta per l’osservazione TEM. In questo modo si evita il sezionamento seriale, che richiederebbe tempi molto lunghi, e la perdita di regioni che potrebbero essere importanti nella caratterizzazione di particolari modelli di patologie, in cui le regioni di interesse per l’analisi sono localizzate in maniera random, non prevedibile, all’interno dei campioni.

Coherent Anti-Stokes Raman Scattering

La microscopia CARS permette di raccogliere immagini di un campione senza la necessità di marcatura fluorescente, con un’eccellente selettività chimica e ad alta risoluzione spaziale. È uno strumento molto promettente per un vasto spettro di aree di ricerca, dagli studi biofisici a livello subcellulare, alla scienza dei materiali alla nanoscala.

La differenza in frequenza dei fotoni di “pompa” e “Stokes” è scelta in modo da eccitare selettivamente un modo di vibrazione selezionato del campione (wvib). La popolazione fononica generata è sondata da un terzo fotone che induce una emissione coerente di radiazione anti-Stokes. Segnali di diversi ordini di grandezza più intensi dello scattering Raman spontaneo possono essere ottenuti grazie al build-up coerente della radiazione e tramite l’uso dei laser impulsati.

Al CNI sviluppiamo la microscopia CARS risolta in polarizzazione e abbiamo concepito una tecnica, rotating-polarization CARS (RP-CARS), che permette di determinare il grado di ordine spaziale di legami chimici selezionati ed il loro orientamento medio anche su aree di imaging molto ampie. RP-CARS è una tecnica di elezione per registrare immagini di assoni mielinizzati, a causa del forte segnale CARS generato dagli abbondanti legami CH2.

Abbiamo mostrato che il grado di anisotropia dei legami CH2 nelle guaine mieliniche (quantificato con un indicatore numerico che viene calcolato per ciascun pixel dell’immagine) presenta una correlazione significativa con il loro stato di salute in un modello chimico di demielinizzazione, aprendo la strada ad applicazioni cliniche dell’RP-CARS nel campo dei disordini neurodegenerativi.

Analisi molecolare Real-time 4D in nanostrutture dinamiche subcellulari

In molte circostanze naturali, le singole molecole esercitano le loro funzioni come parte di un sistema nanoscopico che cambia continuamente e rapidamente posizione e forma nel tempo e nello spazio. Non esiste alcun metodo che permetta di studiare il comportamento di singole molecole in queste condizioni e in un ambiente 3D. Il CNI@NEST punta ad affrontare questa sfida sviluppando metodi di imaging e di analisi basati su un nuovo tipo di microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale. Come piattaforma strategica, proponiamo di focalizzare un fascio di eccitazione in un’orbita periodica attorno alla nanostruttura di interesse (marcata con fluorescenza). Il segnale risultante sarà usato come feedback per localizzare la posizione della nanostruttura con una risoluzione spaziale (~10 nm) e temporale (~1000 Hz frequenza di risposta) senza precedenti. In concomitanza, stiamo sviluppando nuovi strumenti analitici basati sulla spettroscopia a correlazione di fluorescenza spaziotemporale (FCS), che fornisce concettualmente le stesse quantità fisiche delle tecniche classiche di intercettamento di singole particelle (SPT) ma usando piccoli, anche deboli, marcatori molecolari (i.e. con minima perturbazione del campione), senza la necessità di specifici modelli interpretativi. Di particolare interesse è la capacità di ottenere con questi approcci una risoluzione della dinamica molecolare media che va ben al di sotto delle dimensioni limite imposte dalla diffrazione. Adattando e combinando questo insieme di strumenti analitici lungo l’orbita, possiamo realizzare per la prima volta studi sulle singole molecole lungo un sistema di riferimento che si muove con esse. Noi crediamo che questa strategia abbia la potenzialità di sviluppare un approccio multifunzionale flessibile, basato sulle nanotecnologie e capace di rispondere a qualsiasi problema biologico che coinvolga il comportamento di singole molecole su nanostrutture dinamiche. Il nostro approccio permetterà di spingere in avanti la frontiera della conoscenza attuale sulla materia vivente.

Nano Bio Design

L’obbiettivo di questa ricerca riguarda lo sviluppo di nano-architetture innovative per la medicina e la catalisi. Le nanostrutture metalliche hanno dimostrato proprietà molto interessanti, soprattutto per lo sviluppo di agenti teranostici per neoplasie. Purtroppo il loro utilizzo è rimasto limitato ai laboratori di ricercaa causa della loro persistenza negli organismi. Il dilemma tra la scelta della dimensione delle particelle necessaria per le applicazioni cliniche e l’efficienza della loro eliminazione dal corpo è una sfida stimolante. Al CNI, il nostro approccio è lo sviluppo di nano-architetture inorganiche biodegradabili con una struttura simile a frutti della passione, capaci cioè di accoppiare le intriganti proprietà delle nanostrutture metalliche con la possibilità di escrezione completa dall’organismo mediante la via urinaria. La versatilità delle nano-architetture è data dalla possibilità di: i) funzionalizzare la loro cavità interna con fluorofori, farmaci e/o agenti chelanti, ii) variare il tipo di metallo contenuto nella nanostruttura in funzione dell’applicazione finale, e iii) modificare e funzionalizzare la superficie esterna con aptameri, anticorpi, peptidi o polimeri. Le nano-architetture studiate al CNI sono promettenti strumenti per applicazioni terapeutiche e di imaging, tra i quali, il rilascio dei farmaci, radio/chemio terapia, fotoacustica e risonanza magnetica.

Inoltre le nanostrutture metalliche hanno anche dimostrato un vasto spettro di applicazioni in catalisi, ma la necessità di coprire la loro superficie con agenti stabilizzanti riduce la loro efficienza. Per sfruttare al massimo le loro potenzialità, abbiamo disegnato e sviluppato nanoparticelle metalliche con una superficie “nuda”, ma protette dall’ambiente esterno inserendole in una capsula di silice permeabile. I nostri sforzi sono, in particolare, indirizzati alla rimozione delle sostanze inquinanti atmosferiche (VOC ed NOx) e conversione di idrogeno

L’imaging con Risonanza Magnetica (MRI) è una potente tecnica diagnostica, ampiamente applicata nella clinica e nella ricerca pre-clinica, offrendo diversi vantaggi: non è invasiva, ha una penetrazione profonda nei tessuti, e ha un’elevata risoluzione spaziale. Gli agenti di contrasto magnetico sono usati di routine per aumentare il contrasto dell’immagine, ed aiutano a discriminare tra tessuti differenti. Come agenti di contrasto sviluppiamo nanoparticelle magnetiche (MNP) che sono in grado di aumentare la loro percentuale di rilassamento trasversale (R2), e di fornire contrasto negativo. Come proprietà aggiuntiva, le MNP se caricate con farmaci possono coniugare insieme una proprietà diagnostica con una terapeutica si parla infatti di teranostica. Lo sviluppo di MNP in grado di colpire solo le zone interessate all’eventuale rilascio del farmaco caricato, possono ridurre gli effetti nocivi e le dosi di farmaci antitumarali solitamente molto tossici per l’organismo. La nostra ricerca in tale ambito si concentra su:

  • Sviluppare MNP per MRI in grado di portare risultati quantitativi nel microambiente cellulare.
  • Disegnare nanosonde con target per puntare, con maggiore specificità molecolare e sensibilità, a bersagli cellulari ed a compartimenti tissutali in altro modo inaccessibili per agenti di contrasto convenzionale;
  • Sviluppare nuovi agenti di contrasto capaci di realizzare imaging multimodale, combinando MRI con altre tecniche diagnostiche, come l’imaging ottica o PET.

I recettori ad attività tirosin-chinasica (RTK) costituiscono una grande famiglia di proteine di membrana, fisiologicamente coinvolte nella regolazione di una miriade di funzioni biologiche tra cui crescita, proliferazione, sopravvivenza e differenziamento cellulare. La loro attivazione avviene di solito a seguito del legame di uno specifico ligando (ad es. fattori di crescita, ormoni, citochine) sulla loro porzione extracellulare. Gli RTK catalizzano il trasferimento di un gruppo γ-phosphate dal substrato ATP al gruppo idrossile di residui di tirosina posti nella loro sequenza o in quella di altre proteine effettrici; questo genera la propagazione di un segnale proliferativo a cascata. La fosforilazione delle tirosine è la modifica post-traduzionale chiave di queste proteine, è altamente conservata dai procarioti agli umani, e deve essere finemente controllata per garantire il loro corretto funzionamento. Vari RTK sono attivati costitutivamente a seguito di amplificazioni geniche o mutazioni in numerose patologie tumorali, dove giocano un ruolo importante nella progressione del tumore perchè up-regolano l’angiogenesi, la proliferazione e la metastasi. Quindi, questi recettori di membrana costituiscono allo stesso tempo una classe importante di bersagli farmacologici e degli interessanti elementi di targeting negli approcci di nanomedicina. La nostra attività di ricerca mira a i) marcare gli RTK e i loro ligandi con stechiometria controllata e con una grande varietà di sonde come la biotina, i piccoli fluorofori organici, quantum dots, nanoparticelle; ii) controllarne il livello di espressione una volte espressi in cellule di mammiferi, ad es. usando vettori lentivirali combinati a promotori inducibili; iii) visualizzare gli RTK con la risoluzione di singole molecole sulla membrana plasmatica di cellule vive. Usando il recettore TrkA come paradigma, abbiamo precedentemente dimostrato che la mobilità di membrana degli RTK è altamente predittiva del loro stato di attivazione. Stiamo attualmente studiando come essa sia influenzata sia da componenti strutturali della cellula che da mutazioni patologiche che alterano l’attività chinasica degli RTK. Possibilmente questo porterà a identificare nuovi bersagli terapeutici nella deregolazione dell’attività degli RTK.

Un goal innovativo delle nanobiotecnologie è quello generare nuove proteine che si autoassemblano in nanoarchitetture complesse. Importanti applicazioni sono la costruzione di biomateriali, nanovettori e nanosensori bioattivi, dalla biomedicina alla bioelettronica. La natura ha sviluppato già diverse biostrutture complesse su scala nanometrica per la vita cellulare. Queste coinvolgono proteine che si assemblano con interazioni non covalenti ad alta specificità, come i capsidi virali ed i microtubili. Lo scopo della nostra ricerca è quello di ingegnerizzare e generare nuove impalcature di (metallo)proteine bio-ispirate, che possano auto-assemblarsi dietro stimolazione, in stabili nano-biostrutture 3D, quali gabbie e cristalli biomolecolari. Questo processo è fortemente trainato da specifiche necessità tecnologico-applicative.

Gli strumenti primari di ricerca comprendono approcci di ingegneria di proteine, espressione su vasta scala di proteine ricombinanti tramite cellule di mammifero e batteriche, biocristallizzazione, e biofisica strutturale (principalmente cristallografia a raggi x, scattering di raggi X e di neutorni, microscopia e tomografia elettronica,Plasmone di superficie risonanza plasmonica di superfice e microcalorimetria). Abbiamo accesso ai più importanti poli scientifici europei di luce di sincrotrone e di scattering di neutroni. Nel complesso, questi sono tra i più sofisticati e potenti approcci per lo studio della struttura e della dinamica di proteine a livello atomico, e permettono di caratterizzare la termodinamica e la cinetica delle loro interazioni. Tali parametri sono quelli chiave per ingegnerizzare efficacemente le biomolecole ed il loro assemblaggio gerarchico.

Questa linea di ricerca si concentra sullo sviluppo di sequenze sintetiche per il rilascio mirato del carico utile terapeutico o diagnostico nelle cellule trasportato da nanostrutture. Il Centro principalmente si occupa di ingegneria razionale ed ottimizzazione di aptameri peptidici e oligonucleotidici attraverso la combinazione di approcci computazionali/sperimentali, e lo sviluppo di nuove nano-architetture in grado di realizzare il rilascio mirato congiunto di agenti terapeutici. In confronto ai “piccoli” farmaci, questa strategia porta ad un aumento di attività terapeutica con effetti trascurabili di mancato bersaglio, permettendo quindi l’uso di dosi di farmaco più modeste. In aggiunta, il rilascio congiunto e mirato permette di portar avanti due azioni terapeutiche allo stesso tempo, e.g. attività citotossica del farmaco ed inibizione dei meccanismi anti-apoptotici generati localmente nelle cellule bersaglio.

Laboratori

  • TEM Lab
  • Strutture per la sintesi chimica
  • NMR
  • Microscopia Confocale
  • SEM
  • Caratterizzazione di materiali 2D
  • Microscopia CARS

The CNI è ospitato all’interno del laboratorio NEST della Scuola Normale Superiore con cui condivide le sue strutture di ricerca: NEST facilities.